Большая техническая энциклопедия
2 4 7
D L N
А Б В Г Д Е Ж З И Й К Л М Н О П Р С Т У Ф Х Ц Ч Ш Щ Э Ю Я
РА РВ РЕ РО РТ РУ РЫ

Разделенное вещество

 
Разделенные вещества на ТСХ могут быть обнаружены и идентифицированы колориметрическим или другими физико-химическими методами.
Разделенные вещества элюируются из хроматографической колонки потоком газа-носителя, регистрируются детектором и фиксируются на хроматограмме в виде пиков. Полученная хроматограмма служит основой для качественного и количественного анализа смеси веществ. Метод газовой хроматографии применяется для анализа летучих веществ либо веществ, которые могут быть переведены в летучие с помощью специальных приемов и устройств в парообразное состояние.
Разделенные вещества, попадая в пламя, частично де-сорбируются, частично разлагаются: полученные продукты сразу детектируют, поскольку источником локального нагрева в данном случае выступает сам детектор. На результаты детектирования влияет ряд параметров: размеры хроматограммы пластинки; толщина слоя сорбента; расположение хроматограммы в пламени; скорость перемещения хроматограммы в пламени.
Если разделенные вещества обладают собственной окраской или флуоресцируют при облучении УФ-светом, то после хроматографического разделения их можно просто обнаружить.
Интегральные показания прибора, полученные с использованием различных фильтров. Очень часто разделенные вещества, хотя и близкие по свойствам, имеют различные окраски, так что может быть подобран подходящий фильтр. Алкалоиды митрагины образуют соединения от красновато-фиолетовых до темных красновато-коричневых иветов, если их нагревать с хлоридом железа и хлорной кислотой.
Чтобы идентифицировать разделенные вещества, элюированные с пластинки, применяя методы спектроскопии, используют приготовленные вручную стеклянные пластинки с нанесенным слоем силикагеля Merck Silica Gel HF254 или HR, так как эти адсорбенты, как было показано, почти не содержат органических загрязнений.
Для идентификации разделенных веществ успешно применяется множество химических реакций с органическими реагентами. Такие реакции, хотя логически они осуществимы, имеют то неудобство, что зона при испытании уже больше не может быть приведена к своему первоначальному виду; с другой стороны, преимущество спектроскопического исследования компонентов смеси состоит в том, что химические реакции могут быть выполнены позднее, если это потребуется.
Тогда зоны разделенных веществ с RJ 0 5 приблизятся к фронту ( R f 1), что означает отсутствие разделения. В этом случае получаемая из хромато-граммы как качественная, так и количественная информация становится ненадежной. Использование сэндвич-камеры с ненасыщенной газовой атмосферой в типично адсорбционной хроматографии позволяет проводить разделение в лучших условиях. Как известно, механизм рас-деления на тонком слое силикагеля большей частью является промежуточным между адсорбционным и распределительным.
Обнаружение зон разделенных веществ на хроматограмме обычно производится опрыскиванием подходящими растворами, дающими цветные или люминесцентные реакции с открываемыми ионами.
Для обнаружения разделенных веществ на слоях сефадекса его можно обработать непосредственно, как описано раньше; можно также прижать к слою полоску влажного фильтра и выдерживать 40 - 50 мин. Бумагу затем удаляют, сушат и опрыскивают реактивом для обнаружения.
Схема прибора Виланда и Фишера для электрофореза на бумаге.| Стеклянный пульверизатор для обрызгивания бумажных хроматограмм. Для исследования разделенных веществ пользуются теми же качественными реакциями и количественными методами, которые описаны в соответствующих главах этой книги. Для проявления бумажных хроматограмм их обрызгивают специальными реактивами, состав которых приводится ниже при описании отдельных методов анализа. Для обрызгивания пользуются специальным пульверизатором. Обрызгивают равномерно и обильно, но не до такой степени увлажнения, чтобы раствор начал капать с бумаги. Обычно обрызгивание проводят под тягой. На рис. 237 изображен хорошо зарекомендовавший себя стеклянный пульверизатор.
Количественное определение хроматографически разделенных веществ может быть выполнено двумя путями: либо вещество удаляется с адсорбента, а затем определяется, либо количественное определение производится непосредственно на слое сорбента.
Универсальный способ детектирования разделенных веществ заключается в том, что при приготовлении пластинок к адсорбенту прибавляют неорганический фосфор и таким образом получают флуоресцирующие пластинки. Поскольку органические вещества чаще всего гасят флуоресценцию, то в ультрафиолетовом свете они обнаруживаются в виде темных пятен. Если вещества сами флуоресцируют, то под воздействием УФ-излучения они обнаруживаются в виде светлых пятен на темном фоне.

Количественное определение хроматографически разделенных веществ может быть выполнено двумя способами: удалением вещества с адсорбента с последующим количественным его определением; количественным определением непосредственно на слое сорбента. Второй способ более чувствительный.
Если выделение хроматографически разделенных веществ из их смеси с газом-носителем сопровождается образованием тумана, то этого можно избежать с помощью чисто термических методов. В основе всех этих методов лежит уравнение (4.2), и все они связаны с поддержанием молекул улавливаемого вещества в перегретом состоянии вплоть до их окончательного контакта со стенкми сосуда.
Для заданной чистоты разделенных веществ существует определенный диапазон значений отношения скоростей потоков газа и жидкости, который зависит от числа теоретических тарелок в колонке.
Полная идентификация хроматографически разделенных веществ о применением прерывистого злюи-рования и пиролитической ГХ.
При получении масс-спектра разделенного вещества десорбиро-ванный раствор вводят шприцем через прокладку непосредственно в устройство для ввода образца в масс-спектрометр.
Раздезхение эфиров п-оксибензойной кнсдоты. а на силикагене КСЕ. б на Оилоксилюне. В первом случае - разделенные вещества могут быть выделены в чистом виде для препаративных целей, кроме того, чувствительность метода значительно выше.
Для обнаружения и выделения разделенных веществ применяют хорошо разработанные методы, используемые при хроматографировании на бумаге, включая методы двумерного разделения. Следует отметить, что методы хроматографии и электрофореза на бумаге основаны на совершенно различных свойствах разделяемых веществ и дополняют друг друга. Поэтому лучшие результаты дает сочетание этих двух методов. Наиболее широкое применение электрофоретический метод получил в биохимии, в частности, для разделения сывороточных белков, гидролизатов нуклеиновых кислот, аминокислот и пептидов.
Простейшее устройство для радиальной хроматографии. В пятнах и полосах разделенных веществ после опрыскивания пластинки специальной смесью реагентов идут химические реакции, приводящие к развитию окраски, что позволяет не только визуально обнаруживать пятна, но и оценивать содержание в них веществ спектрофотометрическн - по интенсивности поглощения света определенной длины волны. Современные сканирующие денситометры ( с монохроматором или набором фильтров) работают в отраженном свете, что позволяет исключить поглощение в стеклянной подложке и денситометрировать пятна на пластинках с непрозрачной подложкой.
Для обнаружения и выделения разделенных веществ применяют хорошо разработанные методы, используемые при хроматографировании на бумаге, включая методы двумерного разделения. Следует отметить, что методы хроматографии и электрофореза на бумаге основаны на совершенно различных свойствах разделяемых веществ ж дополняют друг друга. Поэтому лучшие результаты дает сочетание этих двух методов. Наиболее широкое применение электрофоретический метод получил в биохимии, в частности, для разделения сывороточных белков, гидролизатов нуклеиновых кислот, аминокислот и пептидов.
Изменить химическим путем природу частично разделенных веществ перед проявлением во втором направлении с использованием прежних неподвижной и подвижной фаз.
В отдельных случаях для локализации разделенных веществ можно использовать такие реактивы, которые не мешают последующему применению ( после экстракции пятен) второй цветной реакции, необходимой для колориметрического определения. Для второй цветной реакции применяют другой реактив, действующий на другую функциональную группу определяемого соединения. Так можно разделять эфиры жирных кислот, локализовать их парами иода и после проявления количественно определить колориметрически, переведя эфиры в окрашенные железные комплексы гид-роксамовых кислот [37] ( см. стр. Воспроизводимость метода была проверена на смеси метиловых эфиров пальмитиновой, 6-оксистеариновой и 9, 10-диоксистеариновой кислот. Этим же методом были проанализированы смеси моно -, ди - и триглицеридов [37] ( ср. Гликолипо-идные фракции липоидов мозга были окрашены аммиачным раствором бром-тимолового и определены колориметрически после экстракции антронсерной кислотой [17] ( ср. Фракции липидов человеческой плазмы [11] и сфингомиелиновые компоненты липоидов мозга [17] были окрашены на хроматограмме аммиачным раствором бромтимолового синего и озолены, и затем в их зоне колориметрически определено содержание фосфора ( ср.
На слое сорбента локализуют зоны разделенных веществ и вокруг определяемой зоны полностью удаляют сорбент, снимая его с пластипки бороздкой в форме кольца. В образовавшуюся выемку помещают эластичную и непроводящую прокладку, а к ней прикрепляют полярографическую ячейку оригинальной формы так, чтобы ее нижняя плоскость плотно прилегала к поверхности слоя сорбента. В образовавшуюся полость подают соответствующий электролит и проводят далее определение обычным способом. Объем электролитической ячейки, образованной стеклянной подложкой, изолирующей прокладкой ( например, из силиконовой резины) и поверхностью держателя электродов, составляет 100 - 200 мкл. Рабочий электрод изготовляют преимущественно из углеродной ласты.
Известен ряд устройств для детектирования разделенных веществ непосредственно на ТСХ-пластинке. Ди Сте-фано и Марини [18] предложили кондуктометрический детектор для бумажной, тонкослойной и колоночной хроматографии. Мост Уитсто-на связан с усилителем, выходной сигнал которого поступает на самописец.

Устанавливают температуру испарителя и отбора разделенных веществ и температуру колонки.
Второй способ предусматривает предварительное вымораживание разделенных веществ из элюата ( с использованием микропрепаративных методов) и их последующее нанесение на старт тонкослойной пластинки.
В отдельных случаях для локализации разделенных веществ можно использовать такие реактивы, которые не мешают последующему применению ( после экстракции пятен) второй цветной реакции, необходимой для колориметрического определения. Для второй цветной реакции применяют другой реактив, действующий на другую функциональную группу определяемого соединения. Так можно разделять эфиры жирных кислот, локализовать их парами иода и после проявления количественно определить колориметрически, переведя эфиры в окрашенные железные комплексы гид-рок Самовых кислот [37] ( см. стр. Воспроизводимость метода была цроверена на смеси метиловых эфиров пальмитиновой, 6-оксистеариновой и 9, 10-диоксистеариновой кислот. Этим же методом были проанализированы смеси моно -, ди - и триглицеридов [37] ( ср. Гликолипо-идные фракции липоидов мозга были окрашены аммиачным раствором бром-тимолового и определены колориметрически после экстракции антронсернои кислотой [17] ( ср. Фракции липидов человеческой плазмы [11] и сфингомиелиновые компоненты липоидов мозга [17] были окрашены на хроматограмме аммиачным раствором бромтимолового Синего и озолены, и затем в их зоне колориметрически определено содержание фосфора ( ср.
Хроматограмма смеси пестицидов, записанная при помощи рефрактометрического детектора ( растворитель - изооктан. расход 0 8 мл / мин. колонка длиной 1 2 м. Поскольку вытекающий из колонки растворитель содержит разделенные вещества, многие из которых имеют специфические группы, способные к поглощению, для детектирования был предложен ряд спектральных методов, основанных на измерениях поглощения света веществом в определенной части спектра, например в ультрафиолетовой или инфракрасной области. Поскольку детектирование проводится непрерывно и невозможно осуществить измерение во всем спектре поглощения, снимают лишь поглощение при фиксированной длине световой волны, которую выбирают таким образом, чтобы детектор был пригоден для измерения возможно большего числа веществ.
Если, однако, можно локализовать разделенные вещества без их дальнейшего превращения, например по их собственной флуоресценции или по поглощению в ультрафиолете на пластинках, покрытых флуоресцирующим составом, и если после экстракции вещества имеются в количествах, достаточных для применения физико-химических методов определения, то эту возможность обычно следует использовать.
Хроматограмма смеси пестицидов, записанная при помощи рефрактометрического детектора ( растворитель - изооктан, расход 0 8 мл / мин. колонка длиной 1 2 м. Поскольку вытекающий из колонки растворитель содержит разделенные вещества, многие из которых имеют специфические группы, способные к поглощению, для детектирования был предложен ряд спектральных методов, основанных на измерениях поглощения света веществом в определенной части спектра, например в ультрафиолетовой или инфракрасной области. Поскольку детектирование проводится непрерывно и невозможно осуществить измерение во всем спектре поглощения, снимают лишь поглощение при фиксированной длине световой волны, которую выбирают таким образом, чтобы детектор был пригоден для измерения возможно большего числа веществ.
Если, однако, можно локализовать разделенные вещества без их дальнейшего превращения, например по их собственной флуоресценции или по поглощению в ультрафиолете на пластинках, покрытых флуоресцирующим составом, и если после экстракции вещества имеются в количествах, достаточных для применения физико-химических методов определения, то эту возможность обычно следует использовать.
Очень часто для получения достаточного количества разделенных веществ требуется несколько раз повторять один и тот же цикл разделения. В связи с этим большие усилия были затрачены на автоматизацию процесса сбора разделенных веществ. К сожалению, такая автоматизация возможна лишь в случае относительно простых разделений, выполняемых с помощью обычных методов. Смеси же, используемые в исследовательских лабораториях, часто настолько ценны, что потери разделенных веществ, происходящие при переключении автоматического устройства для отбора фракций, совершенно недопустимы. Успешная автоматизация возможна лишь в случае абсолютно стабильной нулевой линии детектора. Программирование температуры колонки еще больше затрудняет дело. Рассмотрим, например, хроматограмму разделения эфирного масла, приведенную на рис. 7.22. Если пороговый уровень - переключения устройства для отбора фракций установить на уровне, равном 5 % полного отклонения пера самописца ( это не такой уж высокий уровень), то будет утеряна возможность отбора малых хромато-графических пиков. Можно установить разные уровни для разных пиков, но это очевидно можно сделать лишь после тщательного хроматографирования данной смеси.
Второй важной технической проблемой является улавливание разделенных веществ при больших расходах газа-носителя.
Существует и другой универсальный способ детектирования разделенных веществ. При приготовлении пластинок для тонкослойной хроматографии к адсорбенту прибавляют неорганический фосфор и таким образом получают флуоресцирующие пластинки.
Улавливание и сбор на выходе колонки уже разделенных веществ представляет некоторые трудности. Разделенные вещества находятся в паровой фазе, для улавливания их необходимо сконденсировать. На выходе колонки для этого используют специальные сборники фракций, представляющие собой емкости, заполненные инертной насадкой. Сборник охлаждается каким-либо хладоагентом, чаще всего жидким азотом. Несмотря на низкую температуру, при которой происходит сбор фракций, полная конденсация обычно не достигается. При резком охлаждении часть вещества уносится в виде тумана или кристалликов потоком газа-носителя.
Вытекающий из колонки поток растворителя с разделенными веществами попадает прежде всего в узел дозирования, в котором отмеряются дозы определенной величины для последующей подачи в систему пробирок для сбора фракций. Дозирование может осуществляться но объему, по весу или по времени. Дозирование по объему осуществляется либо с использованием сифона, объем которого строго задан и может меняться лишь с заменой ячейки, либо с использованием дозировки с изменением положения по высоте контакта для электропроводящих растворов с открыванием крана в момент замыкания цепи. При дозировании по времени через заданные промежутки времени происходит перемещение пробирок для сбора фракций.
Вытекающий из колонки поток растворителя с разделенными веществами попадает прежде всего в узел дозирования, в котором отмеряются дозы определенной величины для последующей подачи в систему пробирок для сбора фракций. Дозирование может осуществляться по объему, по весу или по времени. Дозирование по объему осуществляется либо с использованием сифона, объем которого строго задан и может меняться лишь с заменой ячейки, либо с использованием дозировки с изменением положения по высоте контакта для электропроводящих растворов с открыванием крана в момент замыкания цепи. При дозировании по времени через заданные промежутки времени происходит перемещение пробирок для сбора фракций.

Как уже упоминалось, нецелесообразно проводить окрашивание разделенных веществ на хроматограмме, после чего окрашенные вещества экстрагировать и фотометрировать. Тем не менее этот метод был использован Бар-ролье [2] при количественном разделении аминокислот по Бреннеру и Нидер-визеру [ 31, причем, по-видимому, с успехом. Данные о воспроизводимости этого метода анализа не приведены.
Кроме перечисленных выше методов для идентификации хроматографически разделенных веществ, могут быть использованы кулонометрия, полярография, спектроскопия в ультрафиолетовой и видимой областях, обычный анализ элементарного состава и др. При отсутствии перечисленных дорогостоящих приборов во многих случаях можно воспользоваться классическими методами качественного анализа.
Как уже упоминалось, нецелесообразно проводить окрашивание разделенных веществ на хроматограмме, после чего окрашенные вещества экстрагировать и фотометрировать. Тем не менее этот метод был использован Бар-ролье [2] при количественном разделении аминокислот по Бреннеру и Нидер-визеру [3], причем, по-видимому, с успехом.
Схема прибора для непрерывной ГЖРХ, описанного Шут-том и Коэндерсом. Шутт и Коэндерс разработали систему, в которой разделенные вещества растворяются в потоке сцинтил-лятора.
На движущийся слой наносят пробу, разделяют, разделенное вещество удаляют с ленты и, наконец, использованный адсорбент соскребают.
Затем в этих фракциях обнаруживают или количественно определяют разделенные вещества соответствующими химическими или физическими методами. При снятии такой жидкой хроматограммы более сильно адсорбируемые вещества появляются в элюате позже, чем менее сильно адсорбируемые.
Для элюции выбирают такой растворитель, в котором разделенные вещества хорошо растворимы и устойчивы. Вода ( если необходимо, с добавкой кислоты или аммиака) служит прекрасным растворителем, если только удовлетворяет обоим этим условиям. Если необходимо воспользоваться менее полярными растворителями, следует принимать во внимание адсорбцию вещества.
Затем в этих фракциях обнаруживают или количественно определяют разделенные вещества соответствующими химическими или физическими методами. При снятии такой жидкой хроматограммы более сильно адсорбируемые вещества появляются в элюате позже, чем менее сильно адсорбируемые.
 
Loading
на заглавную 10 самыхСловариО сайтеОбратная связь к началу страницы

© 2008 - 2014
словарь online
словарь
одноклассники
XHTML | CSS
Лицензиар ngpedia.ru
1.8.11