Большая техническая энциклопедия
0 1 3 4 9
D V
А Б В Г Д Е Ж З И Й К Л М Н О П Р С Т У Ф Х Ц Ч Ш Щ Ь Э Ю Я
А- АБ АВ АГ АД АЗ АК АЛ АМ АН АП АР АС АТ АУ АФ АЦ АЭ

Адсорбция - фермент

 
Адсорбция фермента на электродах из сажи практически необратима. После иммобилизации электрод сохраняет каталитические свойства в отсутствие лакказы в растворе.
Адсорбция фермента очень сильно зависит От состава и реакций среды.
При адсорбции ферментов на твердых поверхностях они, как правило, сохраняют свою структуру и проявляют каталитическую активность.
На адсорбцию фермента не оказывают заметного влияния высокие концентрации хлористого калия, фермент элюи-руется исключительно с помощью 2 мМ NAD, если элюирующий буферный раствор содержит 0 2 моль / л соли. Из этих результатов следует, что по своей природе сорбция является биоспецифической. Корректность этой гипотезы подтверждается данными, полученными с аффинным сорбентом, у которого гидрофобная пространственная группа была заменена гидрофильной.
В случае адсорбции фермента на внутренней мембране митохондрий под действием КС1 возможна эффективная солюбилизация аспартатаминотрансферазы. Это можно установить, определив активность фермента в супернатанте после центрифугирования обработанной суспензии при 20 000g в течение 20 мин.
Ван В ь е т, Клесов А. А. Адсорбция цел-люлолитических ферментов на целлюлозе и кинетика действия адсорбированных ферментов: два типа взаимодействия ферментов с нерастворимым субстратом.
По-видимому, эта разница количественно отражает структурную неоднородность целлюлозы по отношению к адсорбции ферментов и низкомолекулярных веществ.
Используя постоянно перемешиваемый реактор и основываясь на расширенной теории Дебая - Хюккеля, Морроу и др. [23] показали, что адсорбция фермента более обратима при низких ионных силах раствора, в то время как при высокой ионной силе этот процесс становится по существу необратимым. С понижающимся линейным градиентом ионной силы десорбция фермента в постоянно перемешиваемом реакторе зависит от времени. Кроме того, показано, что присутствие других белков, например гемоглобина, не влияет на результаты.
Впоследствии было показано, что потеря гидролитической активности ферментов в созревающем зерне и в других растительных объектах происходит в результате адсорбции ферментов на клеточных структурах. Это чрезвычайно распространенное в живой природе явление в ряде случаев определяет собой регулирование ферментативного действия в живой клетке.
Активность ферментов в растениях регулируется не только изменением температуры, реакции среды, действием активаторов и ингибиторов, яо также и связыванием, адсорбцией ферментов на различных коллоидных структурах протоплазмы.
Поляризационные кривые восстановления кислорода на сажевом электроде с адсорбированной лакказой ( J и тирозиназой ( 2 в нейтральном буферном растворе. Значение потенциала 1 21 В, близкое к равновесному потенциалу кислородного электрода, устанавливается на электродах из сажи, которые предварительно выдерживались в растворе лакказы ( 10 - 5 М) в течение суток. Адсорбция фермента на электродах из сажи практически необратима. Небольшое отклонение от теоретического значения равновесного потенциала, по-видимому, вызвано локальным увеличением рН в слое адсорбированного белка по сравнению с рН в объеме раствора.
В пробирку прибавляют 25 мл суспензии трехкаль-циевого фосфата ( 10 мг в 1 мл) и содержимое интенсивно перемешивают стеклянной палочкой. Для полной адсорбции фермента смесь отстаивают на холоде в течение трех часов и затем центрифугируют. К промытому осадку для разложения адсорбента небольшими порциями при помешивании приливают раствор, содержащий около 150 мг ок-салата кальция и 90 мг щавелевой кислоты. В смеси должна поддерживаться реакция, близкая к нейтральной. Для этого в течение получаса при помешивании по мере необходимости добавляют либо оксалат кальция, либо щавелевую кислоту.
Капля жидкости на твердой поверхности. Оказалось, что большей активностью обладает фермент, адсорбирующийся на четном числе слоев стеариновой кислоты, если поверхность стекла вначале была гидрофильной. Такой же результат был получен при адсорбции фермента на нечетном числе слоев, нанесенных на гидрофобную поверхность. Это означает, что гидрофильная поверхность карбоксильных групп не инактивирует фермент.

Мп / х - продукты деструкции субстрата с уменьшенной СП, М, - оли-госахариды с СП больше 2, MI - целобиоза, М - глюкоза. Если субстрат нерастворим, то гидролитической стадии предшествует стадия адсорбции ферментов. Однако роль таких важных параметров, как изменение реакционной способности субстрата под действием ферментов, относительное содержание компонентов целлюлазного комплекса, концентрация ферментного препарата и субстрата, как правило, не учитывается.
В качестве сорбентов - носителей ферментов часто используют гель гидроокиси алюминия или фосфата кальция, диатомит, модифицированный крахмал, бентониты, кизельгуры и др. Сорбцию ферментов осуществляют либо в колонках путем пропускания раствора фермента с определенной скоростью через слой ионитов, либо в реакторах, в которых сорбент определенное время перемешивают с раствором фермента. Полученный продукт затем используют как иммобилизованный ферментный препарат. Адсорбция фермента к носителю не обеспечивает их длительную стабилизацию. Более длительную стабилизацию обеспечивает ионообменное связывание фермента, например на модифицированных ионообменных целлюлозах.
Выделение и очистка ферментов представляют собой трудную задачу вследствие крайне низкого содержания ферментов в растительном и животном материале, а также их нестойкости и коллоидной природы. Среди известных методов получения в чистом виде ферментов большое значение имеет метод адсорбции. При соответственно подобранном рН адсорбция ферментов может происходить на трикальцийфосфате, гидроокиси алюминия, каолине и некоторых других адсорбентах. Адсорбированный фермент вытесняется буферным раствором. Адсорбция ферментов может проводиться в статических условиях, но часто оказывается удобным применять адсорбент в виде хроматографической колонки.
Определение кинетических констант, таких, как Км и Vmax, для липолити-ческих ферментов представляет значительные трудности. Необходимо делать ряд допущений, связанных со спецификой данных реакций. Например, при оценке Км приходится учитывать адсорбцию фермента в суперсубстрат, в который включен субстрат на границе раздела фаз.
Адсорбционные свойства свежеприготовленных алюминиевого и кальций-фосфатного гелей изменяются при хранении. Поэтому в литературе встречаются рекомендации использовать для работы постаревшие ( в течение нескольких недель или месяцев) гели. Однако каждый раз требуемое количество геля, необходимое для адсорбции фермента или балластных белков, приходится подбирать экспериментально. Обычно оно не соответствует количествам, использованным в предыдущем выделении или указанным в методике.
В течение многих лет энзимы и родственные им белковые вещества очищались добавлением сорбента к раствору, что основано на неодинаковом отношении компонентов смеси к различным сорбентам. Сорбенты не захватывают посторонних веществ, находящихся в смеси, оставляя их в растворе. Подбирая подходящий растворитель, фермент можно избирательно отделять от сорбента. Адсорбция фермента зависит от ряда условий: природы сорбента, способа его приготовления, чистоты раствора, содержащего адсорбируемый фермент, объема жидкости, природы растворителя, рН среды, присутствия электролитов и пр.
В настоящее время известны способы, позволяющие иммобилизовать ферменты на носители, обладающие электронной проводимостью. Одним из наиболее перспективных материалов для создания электрокатализаторов на основе иммобилизованных ферментов является углерод. Для получения электродов с большой поверхностью перспективна высокодисперсная сажа, на которую возможна адсорбционная и химическая иммобилизация ферментов. В ряде случаев адсорбция фермента на поверхности сажи практически необратима. С использованием различных связующих из сажи может быть сформован высокопористый электрод, обладающий развитой поверхностью.
Выделение и очистка ферментов представляют собой трудную задачу вследствие крайне низкого содержания ферментов в растительном и животном материале, а также их нестойкости и коллоидной природы. Среди известных методов получения в чистом виде ферментов большое значение имеет метод адсорбции. При соответственно подобранном рН адсорбция ферментов может происходить на трикальцийфосфате, гидроокиси алюминия, каолине и некоторых других адсорбентах. Адсорбированный фермент вытесняется буферным раствором. Адсорбция ферментов может проводиться в статических условиях, но часто оказывается удобным применять адсорбент в виде хроматографической колонки.
Их подвижность указывала на то, что это, по всей вероятности, белок, близкий к глобулинам. Она была неустойчива к нагреванию, инактивировалась следами тяжелых металлбЪ Лри перекристаллизации активность, соотнесенная с содержанием азота в препарате, оставалась неизменной. Самнер сделал вывод о том, что уреаза является одноком-понентным ферментом белковой природы. В качестве дополнительного доказательства, должного опровергнуть традиционные возражения, связанные с допущением адсорбции чрезвычайно активных истинных ферментов на белках, Самнер привел следующий факт. Содержащийся в тех же бобах другой белок, конканаваллин В, не обнаруживал при выделении никакой ферментативной активности, что было бы неизбежно при правильности гипотезы о загрязнении препаратов.
Так как препараты фосфоцеллюлозы отличаются между собой, целесообразно предварительно установить количество ионообменника, необходимое для связывания фермента. Берут ( в расчете на сухой вес) 5 г фосфоцеллюлозы, уравновешенной буфером А, и добавляют определенную порцию раствора белка. В элюате определяют активность глюкозофосфатизомеразы. Последующие порции белка добавляют до полного насыщения ионообменника ферментом. На основе этих данных рассчитывают количество фосфоцеллюлозы, требующееся для связывания всего фермента. Суспензию перемешивают 30 - 40 мин, после чего в элюате определяют ферментативную активность, чтобы убедиться в полноте адсорбции фермента.
Комплексный амилолитический ферментный препарат полу - i чают путем выращивания плесневых грибов на твердой питательной среде с последующей сушкой и измельчением полученной массы. Более активный препарат фермента получают путем экстракции такого грибного солода с последующим выпариванием и сушкой. Для осаждения фермента часто используют и сульфат аммония. Предварительно культуральную жидкость выпаривают при температуре 40 С до 40 % - ного содержания сухих веществ. В Японии для пищевых нужд используют технический препарат амилазы, полученный адсорбцией фермента из культуральной жидкости особо обработанным крахмалом. Затем амилазу вместе с крахмалом лиофилизируют.
При изучении реакций и процессов, происходящих в живой клетке, не всегда можно использовать результаты исследований, полученные при работе с очищенными ферментами. Длительное время оставалось неясным, каким образом в живой клетке находятся в близком соседстве, не приходя во взаимодействие, ферменты и вещества, на которые они могут действовать. Очевидно, в клетке имеется какое-то пространственное разделение ферментов и веществ, поэтому они не взаимодействуют друг с другом. По его мнению, ферменты в живых клетках могут адсорбироваться на поверхностях макрогетерогенных систем, например на белковых веществах протоплазмы клетки, теряя при этом свою гидролитическую способность. Но она может возвратиться в том случае, если ферменты опять перейдут в раствор. Подтверждением правильности этой теории является наличие большого фактического материала. Можно привести следующий пример: А. И. Опарин и А. Л. Курсанов показали, что при адсорбции ферментов на дубильных веществах теряется их гидролитическая активность, но это связано не с изменением самих ферментов, а только лишь с переходом их из раствора в осадок. Если такие ферменты перевести опять в раствор, то активность их восстанавливается.
 
Loading
на заглавную 10 самыхСловариО сайтеОбратная связь к началу страницы

© 2008 - 2014
словарь online
словарь
одноклассники
XHTML | CSS
Лицензиар ngpedia.ru
1.8.11